小分子烷烃碳-氢键的选择性羟化是科学界长期以来一直面临的重要挑战之一，其主要瓶颈在于烷烃分子碳-氢键的键解离能比相应醇产物更高，导致传统的化学氧化容易产生过度氧化产物如醛和酸，甚至二氧化碳等。虽然自然界中存在可以直接选择氧化小分子烷烃的天然酶，比如甲烷单加氧酶MMO、丁烷单加氧酶BMO、以及真菌过加氧酶AaeUPO等，但无论其催化效率还是种类数量都还不能满足工业应用的需求。开发小分子烷烃碳-氢键选择性羟化的工程酶是当前国际前沿研究领域之一，对于实现天然气的“气液转化”利用、满足日益增长的能源与化工原料来源需求和环境保护都有重要意义。
细胞色素P450酶是公认的多功能生物氧化催化剂，其催化惰性碳-氢键选择性氧化的能力尤其受到关注，被认为具有改造为小分子烷烃羟化酶的极大潜力。过去十多年来，以2018年诺贝尔奖得主Arnold教授、以及牛津大学Wong教授、名古屋大学Watanabe教授、马普煤炭研究所Reetz教授等为代表的一批国际知名研究小组已在这一领域取得重要进展，他们利用蛋白质工程和底物误识别策略等手段获得了一系列对丙烷和乙烷等小分子烷烃具有高选择性和高活性的P450工程酶。然而，P450酶催化功能的实现高度依赖还原辅酶NAD(P)H及其复杂的还原伴侣电子传递体系来活化分子氧，这在一定程度上限制了其体外催化应用。最近，青岛能源所丛志奇研究员带领的单碳酶催化研究组开发出双功能小分子（DFSM）促进的细胞色素P450（BM3）过加氧酶催化体系，使其能够直接利用H2O2实现对非天然底物如苯乙烯和苯甲硫醚等的高效氧化，从而解除了NAD(P)H和电子传递体系对P450酶的限制（Angew. Chem., Int. Ed. 2018, 57, 7628-7633. Selected as Very Important Paper and Frontispiece, Highlighted by ChemistryViews, 相关链接：双功能小分子的魔术：青岛能源所开发理性设计P450过加氧酶的新策略）。近日，研究人员将上述策略与酶的半理性设计有机结合，通过对活性口袋关键位点的叠加突变研究，首次成功获得了对丙烷及其他低碳烷烃（C3-C6）具有高羟化活性和选择性的工程P450过加氧酶（图1），其反应总转化数可以和已知唯一可利用过氧化氢氧化小分子烷烃的天然过加氧酶AaeUPO相媲美，产物生成速率与已报道的NADPH依赖P450工程酶高效体系相当。这项研究为开发烷烃小分子碳-氢键选择性羟化的工程酶提供了新的途径和思路。另外，该人工过加氧酶体系还呈现出了与已报道的NADPH依赖P450酶不同的性质，比如对中等链长烷烃的区域选择性差异、对天然酶实现催化功能不可或缺高度保守位点的突变反而有助于催化活性的改善，这些结果显示该人工P450过加氧酶体系在生物催化领域有着更广阔的潜在应用。
目前相关工作已发表在国际催化领域权威杂志ACS Catalysis（影响因子：12.221）上（ACS Catal. 2019, 9, 7350-7355）。博士研究生陈杰为论文第一作者，丛志奇研究员为通讯作者。该研究得到国家自然科学基金、青岛市创新领军人才计划、青岛能源所“一三五”重点培育方向、中科院生物燃料重点实验室主任创新基金等项目的大力支持。（文/图 陈杰 丛志奇）
图1人工P450BM3过加氧酶系统催化小分子烷烃选择性羟化
附录：
Chen, J.; Kong, F.; Ma, N.; Zhao, P.; Liu, C.; Wang, X.; Cong, Z.*, Peroxide-Driven Hydroxylation of Small Alkanes Catalyzed by an Artificial P450BM3 Peroxygenase System. ACS Catal. 2019, 7350-7355.
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